Borelioza 2011 Miaskiewicz Falszywie ujemne wyniki testow.pdf

WYBRANE

PROBLEMY

KLINICZNE

Fałszywie ujemne wyniki testów

serologicznych w kierunku

Borrelia burgdorferi

jako efekt kompleksemii

w przebiegu choroby z Lyme

Karolina Miąskiewicz 1 ,

Ewa Walczak 2 ,

Katarzyna Roguska 3 ,

Jakub Ząbek 3

1 Oddział Chorób Wewnętrznych i Kardiologii

WSzChU św. Anny w Warszawie

2 Zakład Anatomii Patologicznej

Instytutu Reumatologii w Warszawie

3 Zakład Mikrobiologii i Serologii

Instytutu Reumatologii w Warszawie

False-negative results of the serological tests

to Borrelia burgdorferi as an effect of coplexemia

in the course of Lyme disease

STRESZCZENIE

Problem seronegatywności, jeśli chodzi o obecność swoistych przeciwciał dla Borre-

lia burgdorferi (B. bg.) , dotyczy od około 40% surowic pacjentów z podejrzeniem bore-

liozy z Lyme — włączając w to pacjentów z potwierdzonymi w wywiadzie incydentami

pokąsania przez kleszcza i wystąpieniem objawu patognomonicznego, jakim jest rumień

wędrujący ( Erythema migrans ).

Pomimo że dysponujemy szerokim wachlarzem testów bakteriologicznych, serologicz-

nych czy molekularnych (PCR), diagnostyka boreliozy nastręcza wielu trudności i może

prowadzić do uzyskiwania wyników zarówno fałszywie ujemnych, jak i fałszywie dodat-

nich. Przyczyn jest dużo i zostaną uwzględnione w niniejszej pracy.

Praca dotyczy surowic seronegatywnych pod względem przeciwciał anty- B. bg. pacjen-

tów, u których wolne przeciwciała anty- B. bg ., prawdopodobnie związane przez anty-

geny bakteryjne, utworzyły krążące kompleksy immunologiczne (CIC).

Celem pracy była analiza CIC pod kątem obecności przeciwciał przeciwko B. bg. w su-

rowicach pacjentów trudnych diagnostycznie, u których obraz kliniczny wskazywał na

zakażenie krętkiem z rodzaju B. bg.

Badania przeprowadzono na surowicach od 107-osobowej grupy pacjentów z podejrze-

niem boreliozy. Zastosowano nową metodycznie analizę obecności swoistych przeciw-

ciał dla B. bg. Polega ona na wytrącaniu i dysocjacji CIC, a następnie oznaczaniu

w uzyskanej frakcji

Adres do korespondencji:

dr hab. n. med. Jakub Ząbek

Zakład Mikrobiologii i Serologii,

Instytut Reumatologii

im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher

ul. Spartańska 1, 02–637 Warszawa

tel.: (022) 844–30–67

g przeciwciał swoistych dla B. bg.

ISSN 1897–3590

201

WYBRANE

PROBLEMY

KLINICZNE

W 74 surowicach (ze 107 badanych), ujemnych w teście ELISA, wykryto metodą Western-

-blotting we frakcji

g aż w 82% obecność przeciwciał swoistych dla B. bg. Najczęściej

wykrywano przeciwciała dla antygenów: VIsE, p100, p41, p39, OspC i p18, co oznacza,

że wyniki uzyskane powszechnie stosowaną metodą ELISA należy uważać za fałszywie

ujemne i dlatego konieczne jest oznaczanie przeciwciał dla B. bg. także we frakcji CIC.

Autorzy mają nadzieję, że opracowane przez nich nowe podejście, po niezbędnych dla

celów rutynowej diagnostyki uproszczeniach, znajdzie zastosowanie w serodiagnosty-

ce boreliozy i w sposób znaczący zmniejszy liczbę wyników fałszywie ujemnych.

Forum Medycyny Rodzinnej 2011, tom 5, nr 3, 201–209

słowa kluczowe: borelioza z Lyme, krążące kompleksy immunologiczne (CIC), fałszywie-ujemne wyniki

testów serologicznych, związanie swoistych dla Borrelia burgdorferi przeciwciał w CIC

ABSTRACT

The question of seronegativity, if cosider the presence of specific to B. bg antibodies,

concerns about 40% sera of the patients with suspected borreliosis of Lyme — inclu-

ding patients with confirmed by anamnesis incidents of the thick bite and apperrance

of the patognomonic manifestation migrating erythema (erythema migrans).

Beside, that we have got a plenty methods to dispose — the hacteriological, serologi-

cal or molecular (PCR) tests, diagnostic of Lyme borreliosis is still the source of many

problems and may lead to even false-negative results, and also false-positive results.

There is a plenty of reason for that and they will be taken under consideration in the

introduction part.

Presented paper raise the problem of seronegative sera regarding antibodies to B. bg,

where free antibodies have been probably bound to bacterial antigens, forming circu-

lating immune coplexes (CIC).

The goal of the researches was analysis composition of CIC, regarding the presence of

antibodies to B. bg in sera of patients difficult to diagnosis, where the clinical syndroms

strongly sugested the infection with B.bg. spirochaetae.

The researches cover group of 107 patients sera with suspected borreliosis. The new

methodological approach to analysis of the specific to B. bg antibodies was applied.

This method based on precipitation and dissociation of CIC, and next an estimation in

so prepared g fraction specific for B. bg. antibodies.

In 74 sera (from 107 tested), negative in the ELISA test, in 82% of the g fraction speci-

fic antibodies to B.bg. was estimated with using a Western-blott tests. The most frequ-

ently asessed antibodies were directed to antigens: VisE, p100, p41, p39, OspC and

p18, what lead to consideration, that results we have got, with using ELISA method,

should be considered as a false-negative and because of that is necessary to estimate

antibodies to B. bg. also in CIC fraction.

Authors can hope, that worked out a new methodological approach, after necessary for

routine diagnostic simplification, will be usefull in sero-diagnostics of borreliosis and

in a significant way dimnishes the amount of false-negative results.

Forum Medycyny Rodzinnej 2011, vol 5, no 3, 201–209

key words: borreliosis of Lyme, circulating immune complexes (CIC), false-negative results of the

tests, sequestration of specific anti-Borrelia antibodies in CIC

202

www.fmr.viamedica.pl

Karolina Miąskiewicz i wsp.

Fałszywie ujemne wyniki testów

serologicznych w kierunku Borrelia

burgdorferi jako efekt kompleksemii

w przebiegu choroby z Lyme

WSTĘP

Borelioza z Lyme jest przenoszoną przez

kleszcze, przewlekłą, wieloukładową cho-

robą odzwierzęcą, wywoływaną przez kręt-

ka Borrelia burgdorferi ( B. bg. ) . Głównym wek-

torem B. bg. są kleszcze z rodzaju Ixodes [1].

Na podstawie objawów klinicznych wy-

różniono trzy fazy boreliozy w zależności od

czasu trwania zakażenia. W stadium pierw-

szym choroba zaczyna się po około dwutygo-

dniowym okresie utajenia. Pierwszym obja-

wem jest rumień wędrujący ( Erythema mi-

grans ) pojawiający się w miejscu ukąszenia

przez kleszcza [2]. Ponadto większość pacjen-

tów skarży się w tym czasie na objawy grypo-

podobne z bólami stawowo- mięśniowymi.

Druga faza choroby rozpoczyna się po

około 2–10 tygodniach od zakażenia. Po spon-

tanicznym ustąpieniu rumienia pojawiają się

wielorakie manifestacje narządowe [2].

Faza trzecia boreliozy charakteryzuje się

przebiegiem przewlekłym (nawet kilkudzie-

sięcioletnim).

Symptomatologia boreliozy jest bardzo

bogata, a obraz kliniczny (zwłaszcza począt-

kowo) sugeruje inną przyczynę schorzenia.

Nieleczona infekcja krętkiem może dopro-

wadzić do ciężkiego uszkodzenia zajętych

narządów, a nawet do śmierci. Najbardziej

typowe jest zajęcie układu nerwowego i ser-

ca, zapalenie stawów oraz manifestacje skór-

ne (pseudochłoniak boreliozowy, przewle-

kłe zanikowe zapalenie skóry).

Obecnie rozpoznanie boreliozy opiera

się na danych z wywiadu dotyczących uką-

szenia przez kleszcza, wystąpieniu objawów

pod postacią rumienia lub grypopodobnych,

a także dodatnich wynikach badań serolo-

gicznych. Pomimo powszechnie funkcjonu-

jącego schematu rozpoznawania boreliozy

na podstawie badań serologicznych autorzy

spotkali się w swojej praktyce klinicznej

z przypadkami seronegatywnej boreliozy po-

twierdzonej między innymi badaniami histo-

patologicznymi. Świadczy to o potrzebie po-

głębionej diagnostyki serologicznej w uza-

sadnionych stanem klinicznym przypadkach

podejrzeń infekcji krętkiem B. bg.

Dysponujemy szerokim wachlarzem na-

rzędzi diagnostycznych do wykrywania bore-

liozy. Najszersze zastosowanie jako badanie

przesiewowe ma metoda immunoenzyma-

tyczna (ELISA, enzyme- linked immunosor-

bent assay ), która niemalże wyparła starszą

i mniej swoistą metodę immunofluorescen-

cji pośredniej (IFA, indirect fluorescent anti-

body ). ELISA jest metodą wydajną, powta-

rzalną, ale niepozbawioną wad — obserwuje

się dosyć częste reakcje krzyżowe z innymi

drobnoustrojami, między innymi krętkami

kiły, wirusem Epsteina-Barr czy Ehrlichia [3].

Jako test weryfikacji dodatnich wyników

ELISA i IFA stosuje się metodę Western-

blott . Metoda ta pozwala rozpoznać obec-

ność przeciwciał klas IgM i IgG dla wybra-

nego zestawu antygenów o wysokiej swoisto-

ści dla B. bg. Jest to metoda kosztowna i trud-

na w wykonaniu, ale za to cechująca się dużą

czułością i swoistością. Jej wadą są różnice

w interpretacji wyników przez poszczególne

laboratoria oraz niedostateczna ich powta-

rzalność [4].

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR,

polymerase chain reaction ) jest metodą ce-

chującą się bardzo dużą czułością i to stano-

wi zarazem jej największą wadę. W przypad-

ku zanieczyszczenia próbki badanego mate-

riału otrzymujemy wyniki fałszywie dodat-

nie. Zaletą tej metody jest możliwość stoso-

wania różnorodnego materiału, między in-

nymi biopunktatów skóry, płynu stawowego

i płynu mózgowo-rdzeniowego, co pozwala

określić miejsce zakażenia w przypadku, gdy

występuje tylko lokalna produkcja przeciw-

ciał. Obecnie wprowadzono dwa warianty

metody — Real time PCR i Immuno PCR [5].

Z innych, rzadziej stosowanych metod

wypada wymienić badanie bezpośrednie,

hodowlę B. bg. oraz badanie histopatolo-

giczne (metoda Warthin Starry ).

Na oddzielne omówienie zasługuje sero-

diagnostyka neuroboreliozy. Zajęcie układu

Jako test weryfikacji

dodatnich wyników

ELISA i IFA stosuje się

metodę Western-blott

Najszersze zastosowanie

jako badanie

przesiewowe ma metoda

immunoenzymatyczna

203

Forum Medycyny Rodzinnej 2011, tom 5, nr 3, 201–209

WYBRANE

PROBLEMY

KLINICZNE

nerwowego manifestuje się zwykle klinicz-

nie po około 2 tygodniach od zakażenia. Śró-

doponową produkcję przeciwciał zwykle

ocenia się w odniesieniu do stężenia tychże

przeciwciał w surowicy (R IgG). Ważne jest

również określenie stopnia przepuszczalno-

ści bariery krew–mózg na podstawie różni-

cy stężeń albumin w płynie mózgowo-rdze-

niowym i surowicy (R Alb). Indeks R Alb/R

IgG jest przydatnym narzędziem w interpre-

tacji wyników uzyskanych od pacjentów

z podejrzeniem neuroboreliozy.

Dlaczego diagnostyka boreliozy jest za-

tem tak trudna, skoro dysponujemy bogatym

arsenałem badań? Złożoność budowy bak-

terii oraz jej duża zmienność antygenowa,

o której decydują liczne plazmidy, powoduje

szereg trudności interpretacyjnych z powo-

du między innymi indukcji krzyżowo reagu-

jących przeciwciał. W praktyce klinicznej

należy brać pod uwagę możliwość uzyskania

wyników fałszywie dodatnich bądź fałszywie

ujemnych [6]. Najczęstszymi przyczynami

wyników fałszywie dodatnich są reakcje krzy-

żowe, hipergammaglobulinemie — zwłasz-

cza w przebiegu chorób autoimmunologicz-

nych oraz ograniczenie diagnostyki do te-

stów przesiewowych.

Fałszywie ujemne wyniki mogą być spo-

wodowane zbyt wcześnie przeprowadzoną

diagnostyką (podczas gdy pacjent znajduje

się jeszcze w tzw. okienku serologicznym),

a także mogą występować w przypadku stwier-

dzonej u chorego dysfunkcji układu immu-

nologicznego, ograniczonej lokalnie pro-

dukcji przeciwciał (np. w płynie mózgowo-

-rdzeniowym) oraz wewnątrzkomórkowego

przebywania B. bg. Również szeroko rozpo-

wszechnione stosowanie antybiotykoterapii

w początkowym stadium choroby może wy-

wołać osłabienie odpowiedzi humoralnej

i w rezultacie zafałszowanie wyników badań

serologicznych [6].

W niniejszej pracy autorzy skupili się na

przypadkach seronegatywnych pacjentów,

u których krążące przeciwciała zostały zwią-

zane przez antygeny (prawdopodobnie bak-

teryjne) i utworzyły krążące kompleksy im-

munologiczne (CIC, circulating immune

complexes ). Obraz kliniczny najczęściej sil-

nie wskazywał na infekcję krętkiem, pomi-

mo braku jednoznacznego potwierdzenia

w wynikach badań.

Analiza krążących CIC pod kątem obec-

ności przeciwciał przeciwko B. bg. w trudnych

diagnostycznie surowicach (u pacjentów

z obrazem klinicznym wskazującym na obec-

ność zakażenia krętkiem) była celem pracy.

W praktyce klinicznej

należy brać pod uwagę

możliwość uzyskania

wyników fałszywie

dodatnich bądź fałszywie

ujemnych

MATERIAŁ I METODY

Badania obecności przeciwciał dla antyge-

nów B. bg . przeprowadzono na 107 surowi-

cach od pacjentów z podejrzeniem borelio-

zy skierowanych do Zakładu Mikrobiologii

i Serologii Instytutu Reumatologii w latach

2008–2010.

W surowicach oznaczano następujące

parametry:

— poziomy przeciwciał przeciwko antyge-

nom B. bg. oznaczano metodą ELISA

(testem Borrelia IgG/IgM recombinant ),

firmy Biomedica;

— jako test potwierdzenia stosowano test

Western-blotting (test recomLine Borre-

lia IgG/IgM ), firmy Biomedica, ocenę

wyników testu Western-blotting wykony-

wano w oparciu o załączoną do testu su-

maryczną skalę oceny (punktową) dla

poszczególnych przeciwciał;

— poziom CIC oznaczano metodą ELISA

(C1q–CIC kit) firmy Quidel (Stany Zjed-

noczone);

— frakcję wzbogaconą w CIC uzyskiwano

metodą wytrącania glikolem polietyle-

nowym o ciężarze cząsteczkowym 6000

(PEG-6000) według Świerczyńskiej

i wsp. [7];

— frakcję g z osadów PEG-6000 uzyskiwano

przez wytrącenie nasyconym roztworem

siarczanu amonu w pH 3,5 (stosowanym

do dysocjacji CIC) według metody własnej

[8], schemat metody przedstawia rycina 1;

204

www.fmr.viamedica.pl

Karolina Miąskiewicz i wsp.

Fałszywie ujemne wyniki testów

serologicznych w kierunku Borrelia

burgdorferi jako efekt kompleksemii

w przebiegu choroby z Lyme

— białko we frakcji g i osadach PEG-6000

oznaczano spektrofotometrycznie me-

todą według Kalckara [9].

WYNIKI

W wyżej opisanych 107 surowicach przysła-

nych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii

w latach (2008–2010) w celu oznaczenia prze-

ciwciał dla B. bg. z powodu podejrzenia cho-

roby z Lyme (boreliozy) wykonano test ELI-

SA (traktowany jako test przesiewowy), a na-

stępnie wykonano w przypadku wyniku pozy-

tywnego (dla którejkolwiek z klas IgM czy

IgG) test potwierdzenia metodą Western-blot-

ting , w zależności od uzyskanego poziomu

przeciwciał dla antygenów B. bg. Wynik ozna-

czeń przedstawia rycina 2.

W 107 badanych surowicach bezpośred-

nio wynik pozytywny (metodą ELISA) uzy-

skano dla 31%, w tym w klasie IgG 14%,

w klasie IgM 13%, oraz 4% dla klas IgG

i IgM. Zgodnie z przyjętą procedurą anali-

tyczną dla tych seropozytywnych surowic wy-

konano test potwierdzenia metodą Western-

-blotting , uzyskując potwierdzenie tylko

w odniesieniu do 6 z nich (20%).

W pozostałych 74 surowicach (seronega-

tywnych w teście ELISA) zastosowano pro-

Rycina 1. Metoda wytrącania i dysocjacji surowiczych CIC

cedurę wytrącania frakcji g z CIC [8]. W tak

uzyskanej frakcji oznaczono powtórnie me-

todą Western-blotting obecność przeciwciał

dla swoistych antygenów B. bg ., zgodnie

z obowiązującą metodyką. Obecności swo-

istych dla B. bg. przeciwciał wykonanych

metodą ELISA i Western-blotting przedsta-

wiają ryciny 3 i 4.

W przypadku 82% frakcji g z seronega-

tywnych surowic wykryto obecność swoistych

przeciwciał dla B. bg. , których ilość i poziomy

pozwalały zakwalifikować je jako dodatnie

Rycina 3. Częstość występowania przeciwciał dla

antygenów B. bg. oznaczanych metodą Western-

blott we frakcji g z osadu PEG w grupie 74 surowic

seronegatywnych w teście ELISA

Rycina 2. Częstość występowania przeciwciał dla

antygenów B. bg. oznaczonych metodą ELISA

w grupie 107 surowic dla klasy IgG i IgM

205

Forum Medycyny Rodzinnej 2011, tom 5, nr 3, 201–209

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: