Enzymy o kinetyce allosterycznej

Enzymy allosteryczne są białkami zbudowanymi zwykle z kilku podjednostek i działają niezgodnie z kinetyką opisaną modelem Michaelisa-Menten. Krzywa zależności szybkości reakcji od stężenia substratu ma kształt sigmoidalny. Wynika to z faktu, iż w enzymach allosterycznych związanie substratu w jednym miejscu aktywnym może zmienić właściwości drugiego miejsca aktywnego cząsteczki enzymu i tym samym zwiększa jego powinowactwo do substratu. W rezultacie współdziałania podjednostek w wiązaniu ligandów powstaje zjawisko kooperatywności w wiązaniu substratu. Zmiany te opisuje model symetryczny – MWC (Monoda, Wymana i Changeux) lub sekwencyjny (Koshlanda). Miarą kooperatywności jest współczynnik Hilla, obrazujący zależność między połowicznym wysyceniem miejsc aktywnych ([S]50) a ilością podjednostek (n).

Wieolopodjednostkowa budowa enzymów allosterycznych sugeruje, iż zawierają one więcej niż jedno miejsce aktywne. Wyprowadzenie równania dokładnie opisującego zależność aktywności tego enzymu od stężenia substratu jest skomplikowane. Jednak rozwiązując ten problem można skorzystać z uproszczonego sposobu sugerowanego przez Atkinson korzystając z następujących  przesłanek:

1.                 Intermediaty ES, ES2, ES3, itd. są nietrwałymi kompleksami.

2.                 Równowaga pomiędzy enzymem i cząsteczkami substratu jest osiągana błyskawicznie.

            Jeśli więc istnieje n miejsc wiążących ligandy dla substratu S to:

                         k+1                                                                                                    

      E + nS                      ESn                       E + Produkt          

                         k-1     

                                                                 V [S]               

(1)

przekształcamy  równanie       v =   Km + [S]         

                                                     v          [S]n      

(2) do postaci                             V-v        K

Rozwiązując to równanie względem  v uzyskujemy:

                      V[S]n

  (3)       v =   K+ [S]n              - równanie Hilla                           

Jeśli enzym ma tylko jedno miejsce wiązania czyli n = 1, to równanie to jest analogiczne do równania Michaelisa – Menten (1), a wykres zależności v od S jest hiperbolą.

Stałe kinetyczne

Dobrym sposobem transformacji wykresu sigmoidalnego do liniowego jest logarytmowanie równania (2). Stałe kinetyczne będzie można odczytać z liniowego przebiegu tego wykresu.

(4)                               log v/(V-v) = n log [S] – log K

n (współczynnik kierunkowy prostej opisanej równaniem 4) jest miarą liczby miejsc wiążących, jednak w praktyce n jest mniejsze niż w rzeczywistości np. dla tetrameru hemoglobiny n wynosi 2,8. Wynika to z faktu, iż w rzeczywistości intermediaty nie są formami krótkotrwałymi. W tej sytuacji n jest miarą kooperatywności, a K w rzeczywistości jest kompleksową stałą stanu równowag dla enzymów allosterycznych. Jednak w przypadku enzymów allosterycznych szybkość reakcji v nie równa się V/2 dla [S] = K.

v =V/2 dla [S]n =  K, co wynika z równania (2).

W związku z powyższym stała K odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym enzym uzyskuje 50% swojej aktywności. Stężenie substratu, przy którym enzym uzyskuje 50% aktywności maksymalnej, jest powiązane ze stałą K:              

(5)                K = [S]n50         

a po zlogarytmowaniu:

(6)   log K = n log[S]50      

Stałą K dla enzymów allosterycznych możemy wyznaczyć na podstawie wykresu zależności log (v/V-v) względem log [S], gdzie – log K stanowi miejsce przecięcia z osią Y.

Oznaczanie aktywności dehydrogenazy izocytrynianowej

Dehydrogenaza izocytrynianowa (DHGI) drożdży jest enzymem allosterycznym. Katalizuje oksydatywną dekarboksylację L-izocytrynianu do a-ketoglutaranu. Koenzymem dehydrogenazy w tej reakcji jest NAD+. Aktywność tego enzymu jest regulowana z udziałem kilku efektorów takich jak NAD+, ADP i Mg2+ oraz NADH. Reakcja ta jest głównym punktem regulacji szybkości przemian w cyklu kwasu cytrynowego.

L-izocytrynian  +  NAD+                 α-ketoglutaran  +  NADH + H+ + CO2

Miarą aktywności enzymu jest przyrost zredukowanego NAD+ (NADH) z maksimum absorpcji l = 340nm.

Materiały:

      1.   Świeże drożdże piekarnicze                                                           150g

      2.   Celit                                                                                                   -

3.       30mM bufor Tris-HCl  pH 7,4                                                       500ml

4.       100 mM dwuwęglan sodu w H2O                                                  200ml                                                                           

5.       3,0 mM  D,L izocytrynian sodu w buforze (3)                              200ml

6.       2 mM NAD+ w buforze (3)                                                            250ml

7.      6 mM AMP  w buforze (3)                                                              15ml

8.       100mM MgCl2  w H2O                                                                   50ml 

9.       Moździerz

10.    Łaźnia wodna 30oC

11.    Spektrofotometr

12.    Wirówka

Metody:

1.                   Preparatyka enzymu dehydrogenazy izocytrynianowej:

Drożdże piekarnicze (10g) rozcieramy z celitem a następnie dodajemy porcjami 20ml 100mM dwuwęglanu sodowego (w stosunku 1g : 2ml) i ponownie ucieramy na jednolitą masę (ściana komórkowa drożdży jest bardzo wytrzymała na mechaniczne urazy!). Homogenat przenosimy do zlewki na 100 ml i sonifikujemy 6 x 10’’z przerwami 20‘’ (Uwaga! zlewka z preparatem powinna być podczas sonifikacji umieszczona w lodzie). Przenosimy homogenat do próbówki wirówkowej.  Probówki równoważymy bardzo starannie używając wagi a następnie wirujemy w wirówce Beckman przy 25 000 obrotów/min przez 35min. Delikatnie zbieramy pipetą supernatant do zlewki i pozostawiamy w temperaturze pokojowej. Osad odrzucamy. W uzyskanym preparacie oznaczamy aktywność dehydrogenazy izocytrynianowej i stężenie białka (met. Bradford).

2.                   Przygotowanie substratu:

Do doświadczeń przygotuj  L-izocytrynian o następujących stężeniach:  0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mM. W tym celu pobierz od 0,1 do 1,2 ml roztworu DL-izocytrynianu (5) i uzupełnij buforem do objętości 3 ml.

     3.  Oznaczanie aktywności enzymu:

Przed oznaczeniem zmieszaj w kolbie stożkowej :

1ml MgCl2 z 2,5 ml 30 mM buforu Tris-HCl pH 7,4 i 15 ml NAD+ (mieszanina M)

Przygotowanie próby „0”

    W  kuwecie spektrofotometru zmieszaj:

  1,85 ml przygotowanej mieszaniny (M)

  1,2 ml substratu o dowolnym stężeniu

  0,2 ml H2O

  Wstaw do spektrofotometru. Ustaw długość fali l = 340nm. Wyzeruj przyrząd.

Pomiar aktywności próby właściwej

  W  kuwecie spektrofotometru zmieszaj:

1,85 ml p przygotowanej mieszaniny (M)

1,2 ml substratu o najwyższym stężeniu

Wstaw do spektrofotometru

Reakcję rozpocznij dodając 0,2 ml enzymu, włącz stoper i  w ciągu kolejnych 4 min. co 1 min. notuj zmiany absorbancji przy l = 340nm. Jeżeli absorbancja przekroczy wartość 0,9 enzym rozcieńcz 2-krotnie.

Wykonaj analogiczne oznaczenia dla pozostałych stężeń substratu.

4.  Oznaczanie białka metodą Bradford.

Uzyskany preparat enzymatyczny rozcieńcz 0,9% NaCl 50 razy (0,1ml preparatu i 4,9ml 0,9% NaCl). Pobierz 3 próby po 100ml (próby badane) i 100ml 0.9%NaCl (próba zerowa). Następnie do wszystkich prób dodaj 2ml odczynnika Bradford. Zmierz absorbancję przy długości fali l = 595nm względem próby zerowej.

Opracowanie wyników:

1.                   Używając molowego współczynnika absorbcji dla NADH oblicz aktywność enzymu wyrażoną ilością zredukowanego NAD+ na minutę na ml (mmole/min/ml).

2.                   Oblicz aktywność właściwą preparatu.

3.                   Sporządź wykresy:

a.   zależności szybkości reakcji v od stężenia substratu [S]

b.                                            zależności 1/v od 1/[S]

c.                                             zależności log v/(V- v )  od log [S]

4.                   Na podstawie wykresu (c) wyznacz współczynnik Hilla i [S]50 oraz oblicz wartość stałej kompleksowej K.

Obliczenia:

Aktywność właściwą  enzymu wyrażamy w mmolach na minutę na mg białka czyli w U na mg białka:

                                        (mmol x min-1 x mg białka –1)

                                                         ( U x mg białka –1 )    

Współczynnik absorbcji molowej dla NADH w 340 nm wynosi 6,22 x 103 l ´ M-1 ´ cm-1

więc 1mmol/ml NADH ma absorbancję 6,22.

Zgodnie z prawem Lamberta – Beera:

                                  A = c x l x e               gdzie:     A  - absorbancja badanej próby

                                                                                    c  -  stężenie produktu ( szybkość reakcji)

                                                                                    l  -  grubość kuwety (cm)

                                                                                   e -  współczynnik absorbcji molowej

                                                  A

              a więc            c =     

                                               l x e

po uwzględnieniu rozcieńczenia frakcji enzymatycznej i czasu inkubacji:

                                             A340 x R x V/vE               R – rozcieńczenie próby

                                 c =

                                                   tink x l x e                     V    –  objętość całk. próby w kuwecie

                                                                                        vE –  objętość enzymu

                                                                                        tink -   czas inkubacji

                                               A340 x R x 16,25

                                          c =   

                                                 tink x 1 x 6,22

                                                    A340 x R x 2,6