Podstawy technologii wybranych bioproduktów – materiały uzupełniające
Procesy biotechnologiczne odbiegają od klasycznych procesów chemicznych pod względem:
· rodzaju materiału, w tym jego złożoności, zmienności w czasie procesu i wrażliwości na czynniki zewnętrzne,
· wymagań procesowych w zakresie sterylności i powtarzalności,
· rozpiętości skali produkcji (od kilku gramów do wielu ton) i objętości czynnej bioreaktorów (od kilku m3 do setek m3).
Specyficznością procesów biotechnologicznych jest również:
· skomplikowana kinetyka, z reguły o charakterze nieliniowym,
· wymagania dużej dokładności regulacji parametrów bioprocesu w przestrzeni i w czasie (utrzymanie temperatury, pH, stężenia substratów lub produktów),
· inhibicja bioprocesu metabolitami, wymagająca ciągłego ich usuwania ze środowiska reakcji,
· zmienność materiału biologicznego spowodowana wzrostem i obumieraniem komórek oraz zmianami morfologicznymi organizmów,
· nieniutonowski charakter pożywek i jego zmienność w czasie, niekiedy bardzo drastyczna (np. w produkcji ksantanu lepkość środowiska zwiększa się od kilku do kilku tys. mPa · s),
· występowanie stanów nieustalonych.
Biosynteza mikrobiologiczna zmierzająca w kierunku otrzymywania biomasy lub metabolitów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych jest prowadzona wieloma sposobami i w różnych warunkach technicznych w zależności przede wszystkim od rodzaju drobnoustroju oraz od przetwarzanego surowca i wytwarzanego produktu. Klasyczne bioprocesy przemysłowe są realizowane w warunkach tlenowych w bioreaktorach umożliwiających kontrolę fizycznych warunków i ich optymalny przebieg (pomiar i regulację parametrów) przy maksymalnym ograniczeniu lub całkowitym wyeliminowaniu zakażeń. Chociaż poszczególne biotechnologie dość znacznie się różnią to jednak mają wiele cech wspólnych. Zazwyczaj należą do nich następujące zasadnicze procesy jednostkowe:
3. Wydzielanie i oczyszczanie bioproduktów. Produkty biosyntezy (białka, lipidy, enzymy, kwasy organiczne, witaminy, aminokwasy, polisacharydy, biosurfaktanty, antybiotyki, przeciwciała) są wydzielane do cieczy pofermentacyjnej lub pozostają w komórkach w niej zawieszonych. Ciecze z mikroorganizmami, rozpuszczonymi metabolitami i niewykorzystanymi substratami często wykazują dużą lepkość, co w połączeniu z niewielkimi wymiarami zawieszonych cząstek i ich bardzo dużą ściśliwością znacznie utrudnia fizyczną separację. Utrzymanie aktywności biologicznej wielu metabolitów, m.in. enzymów, rekombinowanych białek lub witamin, w czasie wydzielania i oczyszczania wymaga odpowiednich warunków środowiska, tj. temperatury, pH, siły jonowej oraz obecności niektórych związków organicznych. Procesy rozdzielania i oczyszczania substratów lub produktów (ang. up-stream i down-stream processing) są ważną częścią przemysłowych bioprocesów, w tym również ekonomiczną (60-90% całości kosztów), a ich specyfika wynikająca m.in. z wrażliwości materiału biologicznego (np. zmiana konformacji białka wystarcza do pozbawienia go specyficznego działania), podobnych właściwości rozdzielanych związków, małego stężenia metabolitów w cieczy pofermentacyjnej, nieokreślonego składu i/lub właściwości mieszanin wymusza dostosowanie klasycznych metod rozdzielania do specyficznych wymagań materiału i opracowanie nowych rozwiązań typowych dla inżynierii bioprocesowej.
Niezależnie od umiejscowienia bioproduktu (wewnątrz lub na zewnątrz komórek), pierwszym etapem przetwarzania cieczy pofermentacyjnej jest wydzielanie biomasy metodą: konwencjonalną - wirowania, filtracji (typu osadowego, dead-end lub membranowej filtracji dynamicznej, cross-flow) lub mikrofiltracji, sedymentacji lub flokulacji, flotacji, koagulacji bądź niekonwencjonalną - powinowactwa, np. immunomagnetyczną. Frakcjonowanie biomasy metodą wirowania jest bardziej efektywne pod względem wydajności i bardziej energochłonne od filtracji i innych sposobów rozdzielania faz. Z cieczy pofermentacyjnej bioprodukty są najczęściej ekstrahowane rozpuszczalnikami lub płynami w stanie nadkrytycznym, wykrystalizowywane, wymrażane, odparowywane próżniowo, oddestylowywane. Natomiast substancje aktywne fizjologicznie, w szczególności antybiotyki, są wydzielane, oczyszczane i frakcjonowane przez flokulację polimerowymi flokulantami. W pozyskiwaniu metabolitów wewnątrzkomórkowych niezbędną operacją jest dezintegracja biomasy metodami fizycznymi (mechanicznymi), chemiczno-ekstrakcyjnymi lub fizjologiczno-biochemicznymi (np. enzymami litycznymi), przy czym ta ostatnia odbywa się we względnie łagodnych warunkach.
W przyszłości najbardziej powszechną formą bioproduktów będą koncentraty enzymów, witamin, hydrolizatów i antybiotyków paszowych, w postaci cieczy, proszków lub mieszanin z wypełniaczami, stanowiące suchą pozostałość (w tym biomasę) cieczy pofermentacyjnej po częściowym jej przetworzeniu (stabilizacji, oczyszczeniu, zagęszczeniu). Wszystkie metody oczyszczania charakteryzują się dużą liczbą operacji jednostkowych wielokrotnie powtarzanych (filtracja zawiesin, dwu- lub trzystopniowa ekstrakcja, krystalizacja, zatężanie roztworów w wyparkach próżniowych, różne metody suszenia), różnorodnością złożonością i wielkością urządzeń. Produkty biosyntezy, w większości złożone związki organiczne, są podatne na działanie czynników zewnętrznych (podwyższonej temperatury, zmian pH roztworu). W celu zmniejszenia strat termolabilnych składników wykazujących aktywność biologiczną zagęszczanie jest prowadzone w niskiej temperaturze w warunkach obniżonego ciśnienia i ograniczonego czasu kontaktu cieczy z powierzchnią.
Wydzielanie i oczyszczanie bioproduktów uwzględnia pozyskiwanie biomasy (ang. cell harvesting), niszczenie ścian komórkowych (ang. disruption), usuwanie pozostałości po dezintegracji biomasy i innych nierozpuszczalnych substancji, koncentrację bioproduktów, wstępne rozdzielanie (ang. clarification), np. metodą strącania, właściwe oczyszczanie (ang. polishing, product purification), np. metodami chromatograficznymi, utrwalanie bioproduktów.
Wydzielanie produktu biosyntezy ze złożonego układu wielofazowego zawierającego mikroorganizmy, pozostałość pożywki i lipidy, utrudnione małą koncentracją metabolitu i niewielkimi różnicami wielkości, wartości ładunków elektrycznych, struktury cząsteczkowej składników danego układu, zależy od jego chemicznych i fizycznych właściwości oraz od efektywności wstępnego oczyszczania cieczy pofermentacyjnej. Metody wstępnego wydzielania/koncentracji są pracochłonne i decydują o właściwościach bioproduktów, ich aktywności i cenie. Z cieczy pofermentacyjnej można otrzymać suchy koncentrat bioproduktu lub rozdzielić ją na biomasę i klarowną frakcję ciekłą z różnymi metabolitami. Niekiedy celem nadrzędnym przetwarzania bioproduktów jest zachowanie właściwości enzymów, budowy strukturalnej bioproduktu, cech przeciwciał zapewniających właściwą reakcję z antygenami, immunogenności szczepionek.
Najczęściej stosowanymi metodami oczyszczania bioproduktów są ekstrakcja i wymiana jonowa. Wiele produktów biosyntezy, np. kwasy organiczne lub niektóre aminokwasy, wydziela się z cieczy pofermentacyjnej metodą krystalizacji, chociaż bezpośredni proces jest zalecany jedynie w przypadku małej zawartości substancji balastowych i barwnych. Znane są sposoby wydzielania metabolitów w postaci soli, np. w czasie neutralizacji kwasu cytrynowego w cieczy pofermentacyjnej wodorotlenkiem wapnia lub kredą powstaje trudno rozpuszczalny cytrynian wapnia. Zaletą często stosowanego wytrącania enzymów rozpuszczalnikami organicznymi jest ich odzyskiwanie, a wadą – mało selektywne separowanie białek.
Wydzielanie białek w łagodnych warunkach temperatury i pH, przy względnie małych stratach aktywności, umożliwiają procesy membranowe (dializa, elektrodializa, ultrafiltracja, odwrócona osmoza, mikrofiltracja), z których ultrafiltracja jest najbardziej przydatna do ciągłego wydzielania enzymów z cieczy pofermentacyjnej i do ich oddzielania od reszty produktów w reaktorach membranowych. W ciągłych bioprocesach, ze względu na ich dużą selektywność, walory ekonomiczne i zachowawczość wobec aktywnej substancji, bardzo efektywne jest jednoczesne prowadzenie przemiany chemicznej lub biochemicznej i wydzielanie składników z cieczy pofermentacyjnej w bioreaktorze membranowym. Układ taki składa się z bioreaktora (zazwyczaj mieszalnikowego) i sekcji frakcjonowania z modułami: mikrofiltracyjnym (MF), ultrafiltracyjnym (UF) i perwaporacyjnym (PV), umożliwiającymi rozdzielanie składników układu na frakcje o sterowanym czasie przebywania w strefie reakcji. Tradycyjne techniki membranowe (mikrofiltracja, ultrafiltracja) są przydatne do rozdzielania związków znacznie różniących się masą cząsteczkową i w procesach niewymagających dużej rozdzielczości. Nowe rozwiązania procesowe zwiększają zdolność rozdzielczą membran i wydajność modułów filtracyjnych, np. dzięki zastosowaniu obrotowych tarcz filtracyjnych lub specjalnie ukształtowanych przepływów spiralnych. Szczególne znaczenie przypisuje się zastosowaniu technik ze stycznym przepływem cieczy pofermentacyjnej względem membrany określanym mianem HPTFF (ang. High-Performance Tangential Flow Filtration) do oczyszczania białek przy dużym natężeniu przepływu permeatu oraz ograniczonym zapychaniu i blokowaniu membran (ang. fouling) w porównaniu z klasyczną filtracją okresową w przepływie jednokierunkowym lub membran obdarzonych ładunkiem elektrycznym. Przydatność tych technik w biotechnologii została omówiona w opracowaniu Van Reis i Zydney; m.in. do oczyszczania bioproduktów są proponowane membrany chromatograficzne (sorpcyjne), w których, w odróżnieniu od klasycznej chromatografii przy użyciu nieruchomego złoża sorbentu, nie występują utrudnienia pod wpływem oporów dyfuzyjnych masy w złożu. W procesie ciągłym przy użyciu takich membran, np. jednorazowego użytku niewymagających konserwacji, nawet małe ilości zanieczyszczeń są usuwane z dużą sprawnością.
Metody chromatograficzne: adsorpcja, filtracja żelowa, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa, odwróconej fazy i oddziaływań hydrofobowych, stają się coraz częściej konkurencyjne wobec tradycyjnych technik rozdzielania bioproduktów wykazujących aktywność biologiczną. Dla przykładu chromatografia jonowymienna jest jednym z etapów w niemal wszystkich technologiach otrzymywania enzymów o dużej czystości metodą krystalizacji, wymagającym jednak rozcieńczania roztworów, których powtórna dehydratacja w wyparkach próżniowych lub w liofilizatorze zawsze zmniejsza aktywność enzymów. Duże koszty stosowania chromatografii w skali przemysłowej: inwestycyjne (zakup aparatury) i operacyjne (koszty odczynników zużywanych w procesie produkcji i do konserwacji membran) są systematycznie zmniejszane, dzięki wprowadzaniu nowych materiałów, np. ligandów o dużej selektywności i polimerów o dużej porowatości, do bezpośredniego wydzielania metabolitów z nieklarowanych cieczy oraz doskonaleniu technik procesowych, m.in. wprowadzeniu złóż fluidalnych.
Nowością w tym obszarze są tzw. procesy zintegrowane, w których połączono proces biochemiczny i rozdzielanie (np. destylację, ekstrakcję, sorpcję), zwiększając wydajność (np. fermentacji etanolowej, produkcji kwasów organicznych), dzięki usuwaniu metabolitów hamujących rozwój drobnoustrojów. Separacja technikami membranowymi, np. ekstrakcja lub destylacja membranowa, usuwa produkt z cieczy pofermentacyjnej i eliminuje wpływ niekorzystnych czynników (podwyższona temperatura, rozpuszczalniki organiczne). W niektórych technologiach (wydzielanie kwasu mlekowego metodą elektrodializy, ekstrakcja etanolu z cieczy pofermentacyjnej) procesy zintegrowane są bardziej ekonomiczne niż tradycyjne rozwiązania.
Klasyczne metody separacji (destylacja, ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi) mogą powodować dezaktywację bioproduktów lub, jak chromatografia i krystalizacja, są bardzo kosztowne i mało wydajne, co ogranicza ich przydatność w skali przemysłowej. Często w technologiach wymagających dezintegracji komórek do uwolnienia metabolitów wewnątrzkomórkowych obecność resztek ścian komórkowych i duża lepkość homogenatów utrudniają odwirowanie lub filtrację zanieczyszczeń. „Łagodną" i skuteczną metodą separacji aktywnych bioproduktów jest ekstrakcja w wodnych układach dwufazowych (ang. ATPS - Aqueous Two-Phase Systems), która umożliwia jednoczesne oddzielanie biomasy lub jej pozostałości, usuwanie zanieczyszczeń i koncentrację produktu.
Komputerowe sterowanie bioprocesami i automatyczna kontrola podstawowych parametrów gwarantują utrzymanie właściwych warunków ich prowadzenia oraz uzyskanie dużej produktywności i zmniejszenie kosztów wytwarzania. Kontrola parametrów bioprocesu (temperatury, pH, stężenia rozpuszczonego tlenu i dwutlenku węgla, potencjału redoks, parametrów elektrycznych brzeczki) klasycznymi i nowoczesnymi (np. optycznymi) czujnikami informuje o jego aktualnym stanie i w połączeniu z matematycznym modelem procesu, umożliwiającym dynamiczną interpretację danych, ułatwia podejmowanie działań regulacyjnych. Szczególnie przydatne do tworzenia korelacyjnych modeli procesów są sztuczne sieci neuronowe (SNN), coraz częściej stosowane przez największe firmy biotechnologiczne do optymalizowania składu pożywki, maksymalizowania wydajności różnorodnych metabolitów i do bezpośredniego (tzw. adaptacyjnego) sterowania bioprocesem.
4. Utrwalanie bioproduktów. Bioprodukty są odwadniane do zawartości wilgoci 8-10% w dwuetapowym procesie, najpierw w wyniku usunięcia wody bez zmiany jej stanu fizycznego przez wirowanie, filtrację lub strącanie, a następnie w wyniku jej przemiany fazowej przez zagęszczanie, suszenie (w przypadku termolabilnych bioproduktów - sublimacyjne lub rozpryskowe) bądź wymrażanie.
5. Unieszkodliwianie produktów ubocznych lub odpadowych procesu biotechnologicznego. Rzeczywistością najbliższej przyszłości muszą stać się układy bezodpadowych technologii, czyli procesów przetwarzania materiałów niezanieczyszczających środowiska przyrodniczego i gwarantujących racjonalne wykorzystanie zasobów surowców i energii. Wiąże się to ściśle z odmiennym niż dotychczas ukierunkowaniem działań w polityce gospodarczej i w strategii rozwoju na gospodarkę bezodpadową. Znaczenie przemysłu biotechnologicznego będzie nadal wzrastało wraz ze wzrostem zamożności społeczeństwa i większym zapotrzebowaniem na bioprodukty o dużym stopniu przetworzenia i odpowiednio opakowanych. Zastosowanie odpowiednich technologii oraz właściwe zarządzanie jakością i czynnikami, takimi jak: energia, woda, produkty uboczne, odpady i ścieki, sprzyjają ograniczeniu negatywnego oddziaływania tego przemysłu na środowisko. Obecnie w świecie są wdrażane do praktyki tzw. „czyste technologie" (bezodpadowe), które zapewniają nie tylko uniknięcie degradacji środowiska, lecz również zwiększają efektywność produkcji. Temu celowi służą programy „najlepszych doświadczeń" (ang. best practise schemes) lub „zalecanych praktyk" (ang. good practise techniques) oraz „minimalizacji odpadów" (ang. wastes minimisation), które muszą być koniecznie uzasadnione rachunkiem ekonomicznym. Rachunek ekonomiczny opłacalności stosowania procesów biotechnologicznych zwiększających stopień wykorzystania składników produktów ubocznych powinien uwzględniać nie tylko nakłady inwestycyjne i przyszłe nakłady eksploatacyjne, ale również efekty wyrażone zwiększoną ilością bioproduktów oraz mniejszą dewastacją środowiska, m.in. zmniejszonymi kosztami oczyszczania ścieków. Optymalne zagospodarowanie wszystkich surowców stosowanych w procesie biotechnologicznym może realnie zmniejszyć koszty produkcji, a tym samym producent, który atrakcyjniej i taniej je przetworzy, ma szansę taniej sprzedać bioprodukty.
Otrzymywanie białka
Drobnoustroje stosowane do biosyntezy białka powinny charakteryzować się wszechstronnością metabolizowania składników odżywczych pożywki, dobrze rozbudowanym kompleksem enzymów oddechowych i jak najsłabszym kompleksem enzymów fermentacyjnych, odpornością na niekorzystne zmiany składu pożywki oraz cechami technologicznymi ułatwiającymi oddzielenie biomasy od pożywki. Sucha substancja biomasy organizmów jednokomórkowych (ang. SCP - single celi protein) składa się głównie z białka (ok. 70-90% w s.s.), niebiałkowych związków azotowych, lipidów, sacharydów, związków mineralnych i witamin. Skład i budowa ściany komórkowej oraz duża zawartość kwasów nukleinowych w komórce (do 20% w przypadku drożdży) limitują spożycie takiego białka przez człowieka. Dzienne spożycie kwasów nukleinowych przekraczające 2 g podwyższa poziom kwasu moczowego w plazmie krwi, sprzyjając wytrącaniu się jego kryształów, i w następstwie akumulacji w stawach jest przyczyną podagry.
W biosyntezie białka szczególnie przydatne są drożdże Candida, szybko rozmnażające się w pożywkach zawierających produkty uboczne przemysłu rolno-spożywczego i syntezujące enzymy i witaminy z prostych związków. Znane są technologie namnażania biomasy drożdży w pożywce z serwatki lub z permeatu po ultrafiltracji mleka lub serwatki. W większości rozwiązań pożywki z serwatki lub permeatu wymagają pasteryzacji i uzupełnienia składu makro-(fosfor, potas) i mikroelementami (żelazo, miedź, mangan, cynk). Wymóg pasteryzacji eliminuje ultrafiltracja serwatki przy pH 3,2. Efektywnymi rozwiązaniami są technologie Vienna i Bel upowszechnione we Francji. Pierwsza z nich zapewnia wydajność 4,5 g s.s. · dm-3 · h-1 w procesie ciągłym (32-33°C; pH 3,4-3,6; napowietrzanie 40 dm3 · dm-3 · h-1) prowadzonym w serwatce wzbo gaconej amoniakiem przy użyciu Candida intermedia. W technologii Bel trzy szczepy drożdży, spośród których Kluyveromyces marxianus var. lactis utylizuje laktozę i kwas mlekowy, Kluyveromyces marxianus var. marxianus - laktozę, a C. pintolopesii - etanol, są namnażane łącznie w serwatce odbiałczonej termicznie (90°C; pH 4,5) lub w permeacie. Równowaga populacji jest zależna od zawartości tych źródeł węgla w pożywce. Mieszanina szczepów gwarantuje całkowitą transformację laktozy, kwasu mlekowego, a nawet etanolu, który może pojawić się w niewłaściwie napowietrzanej pożywce. Zaleca się stosowanie serwatki odbiałczonej termicznie lub permeatu po ultrafiltracji serwatki, aby zapobiec flokulacji drożdży na niemetabolizowanych białkach serwatkowych.
Surowce ligninocelulozowe mogą być przydatne jako źródło węgla i energii w bioprocesach do produkcji żywności i pasz, m.in. jako pożywka do produkcji grzybów jadalnych lub biomasy drożdży. W takim rozwiązaniu technologicznym celuloza i hemiceluloza są hydrolizowane do monosacharydów, a w hydrolizacie są namnażane drożdże Candida. W porównaniu z melasą lub tradycyjnymi surowcami skrobiowymi surowce ligninocelulozowe są znacznie trudniej przyswajalne przez drobnoustroje syntetyzujące białko i wymagają wstępnego przygotowania, celem uwolnienia celulozy z kompleksów lignino- i hemicelulozowych. Obecnie taka produkcja jest nieopłacalna, nawet metodą hodowli w stałym podłożu (ang. SSF - Solid State Fermentation) z udziałem słomy zbożowej, ryżowej i rzepakowej, plew zbożowych, kaczanów kukurydzy, wytłoków owocowych, trocin, zaliczanej do technologii bezodpadowych.
Technologie drożdży paszowych i piekarskich są podobne, a różnice dotyczą rodzajów drożdży i pożywek oraz metod i warunków suszenia biomasy. Drożdże paszowe są biomasą drożdży niezarodnikujących Candida, Torula i Monilia, szybko rozmnażających się w ubogich pożywkach (heksozy, inne sacharydy, kwasy organiczne, alkohole, aminokwasy), a podstawowymi surowcami do syntezy są melasa, wywar melasowy, serwatka, ługi posulfitowe i substraty niekonwencjonalne (węglowodory, a zwłaszcza n-alkany, alkohole, gaz ziemny).
Drożdże piekarskie są biomasą wybranych ras Saccharomyces cerevisiae namnażaną metodą okresową lub półciągłą w 30°C w kadzi fermentacyjnej z barboterowym systemem napowietrzania lub z wysokosprawnymi systemami napowietrzania (wirnikowy system Vogelbuscha, krajowy system typu SK, samozasysający system wirnikowy firmy Frings) w rozcieńczonych (końcowe rozcieńczenie 1:12-1:25) albo w gęstych (końcowe rozcieńczenie 1:5-1:10) brzeczkach melasowych. Niekiedy jest stosowana metoda zwrotnego wirowania, polegająca na stałym odbiorze i odwirowaniu części brzeczki drożdżowej oraz na zawróceniu mleczka drożdżowego do kadzi i uzupełnieniu ubytku objętości brzeczki nowymi porcjami pożywki, zwiększająca przerób o ok. 50% przy stałym rozcieńczeniu substratu. W większości znanych technologii biomasa drożdży jest oddzielana od pożywki metodą wirowania, przemywana wodą a w przypadku stosowania pochodnych ropy naftowej 3-krotnie ekstrahowana, celem usunięcia potencjalnie rakotwórczych związków benzopirydonowych, i ponownie odwirowywana. Następnie drożdże piekarskie są odwadniane w bębnowych, obrotowych filtrach próżniowych o działaniu ciągłym, formowane i pakowane w warunkach próżniowych lub w atmosferze gazu obojętnego albo suszone w suszarkach tunelowych, bębnowych lub fluidyzacyjnych w temperaturze do 50°C. Drożdże paszowe są suszone w temperaturze ok. 100°C w suszarkach rozpryskowych (rozpyłowych).
Zwiększenie udziału białka mikroorganizmów w żywieniu ludzi wymaga polepszenia strawności i funkcjonalnych właściwości biomasy przez: 1) zniszczenie ściany komórkowej w operacjach autolizy, plazmolizy, dezintegracji mechanicznej, specyficznej hydrolizy enzymatycznej, 2) wyekstrahowanie białka wodą roztworami słabych zasad, kwasów lub soli, 3) usunięcie kwasów nukleinowych. Przyjmuje się, że koszty uzdatniania biomas stanowią 50-80% całości kosztów.
Białko można wydzielić z biomasy natywnych komórek lub po uprzednim zniszczeniu ich ścian komórkowych. Nienaruszone ściany komórkowe utrudniają przenikanie białka i dlatego wydajność ekstrakcji z takich komórek na ogół nie przekracza 50%, nawet po wstępnym działaniu na biomasę związkami zwiększającymi przepuszczalność ścian, np. anionowymi lub kationowymi środkami powierzchniowo czynnymi, rozpuszczalnikami organicznymi lub roztworami niektórych soli nieorganicznych. Ze zdezintegrowanych komórek biomasy białka są wydzielane ze znacznie większą wydajnością i w warunkach sprzyjających jednoczesnemu usuwaniu kwasów nukleinowych. Największa wydajność ekstrakcji białka z biomasy drożdży, do 80-90% związków azotowych, jest uzyskiwana w zasadowym środowisku (pH 11-11,5), w którym udział kwasów nukleinowych jest podobny do udziału w biomasie. Białko jest selektywnie wydzielane z ekstraktu przez ogrzanie przy pH 4,0-4,5 lub po uprzedniej enzymatycznej degradacji kwasów nukleinowych.
Na etapie namnażania drożdży jest możliwe zmniejszenie zawartości kwasów nukleinowych w biomasie do 3,5%, uniemożliwiając bardzo szybki rozwój populacji (np. antybiotykami) lub prowadząc proces początkowo w pożywce bogatej w substrat, a następnie w warunkach głodu substratowego. Duża część kwasów nukleinowych i produktów ich rozkładu jest usuwana z biomasy metodą selektywnej ekstrakcji rozpuszczalnikami bądź hydrolizy w zasadowym środowisku, bądź pod wpływem endogennych lub dodanych nukleaz. Ekstrakcja komórek drożdży mieszaniną metanolu i amoniaku, a następnie wodą w 55°C w czasie 20 min zmniejsza zawartość kwasów nukleinowych w s.s. biomasy do 1%. Dobre rezultaty zapewnia ekstrakcja drożdży mieszaninami metanolu lub etanolu i kwasu solnego, a także wodnymi roztworami kwasu solnego lub chlorku sodu. Niekorzystnym skutkiem ekstrakcji rozpuszczalnikami są straty białka, które zależnie od rodzaju biomasy i warunków procesu osiągają 20-30%.
Ekstrakcja komórek drożdży roztworami NaOH o pH > 10 sprzyja hydrolizie RNA, ale jednocześnie wywołuje niepożądane zmiany chemiczne reszt aminokwasów w białku oraz pogarsza jego właściwości odżywcze i funkcjonalne. Najczęściej stosowaną metodą otrzymywania białka o małej zawartości kwasów nukleinowych jest ekstrakcja stężonymi roztworami zasad w ok. 60°C, a następnie jego wytrącenie w środowisku kwaśnym. Zastosowanie wewnątrzkomórkowych nukleaz wymaga wzbudzenia ich aktywności, najczęściej przez krótkotrwałe ogrzanie do 60-80°C i inkubację biomasy w temperaturze 45-60°C. Szok termiczny uwalnia rybonukleazy z wakuoli zniszczonych ogrzewaniem bądź inaktywuje labilne białkowe inhibitory enzymu. Często ogrzewanie jest poprzedzone zimnym szokiem w temperaturze 0°C albo zawieszeniem komórek w środowisku kwaśnym lub w roztworach EDTA, fosforanów albo chlorku sodu. Niektóre aniony aktywują nukleazy i ułatwiają usuwanie produktów rozkładu kwasów nukleinowych z niezniszczonych komórek. Przydatność zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych rybonukleaz do zmniejszenia zawartości tych kwasów w białku drożdży ograniczają m.in. intensywna proteoliza białka oraz wysokie ceny preparatów enzymatycznych.
Perspektywicznym rozwiązaniem usuwania kwasów nukleinowych zasocjowanych z białkiem drożdży w postaci kompleksu nukleoproteinowego mogą być metody chemiczne. Polegają one na zniszczeniu oddziaływań jonowych głównie między anionowymi grupami fosforanowymi kwasów i kationowymi grupami aminokwasów, np. przez modyfikację anionowych grup RNA lub grup ε-ΝΗ2 białka. W tym celu kompleks nukleoprotein po dezintegracji komórek i odwirowaniu nierozpuszczalnego materiału ściany komórkowej jest ekstrahowany w środowisku o pH 8,5-9, a następnie destabilizowany jedną z metod: sukcynylacji bezwodnikiem kwasu bursztynowego, odwracalnej modyfikacji bezwodnikami kwasu cytrakonowego lub maleinowego, sulfitolizy siarczanem(IV) sodu i czterotionianem sodu, fosforylacji tlenochlorkiem fosforu (POCl3) lub modyfikacji solami chaotropowymi, np. NaClO4 Białko pozbawione 80-95% kwasów nukleinowych jest wytrącane przy pH 4,0-4,2 (w tych warunkach pH kwasy nukleinowe pozostają w roztworze), odwirowywane, dializowane i suszone metodami konwencjonalnymi....
Elesmera